重组酵母摇瓶发酵条件研究
食品工业科技研究与探讨2008年第06期168(山东淄博万杰医学院生物化学教研室,山东淄博)摘要:从碳源、生物素、接种比率、甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对重组酵母摇瓶发酵条件进行了研究,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,发现控制适宜的甲醇浓度十分重要。同时,利用30L发酵罐对长时间甲醇诱导发酵做了研究,发现随着发酵时间的增加,分泌蛋白产量先增加然后下降,菌体生长速度放慢,但菌体湿重一直在增加。关键词:发酵优化,毕赤酵母,摇瓶发酵,甲醇诱导,-lu,Qiao-qiao(,,,China)otin,ion,:on;;;中图分类号:文献标识码:1002-0306(2008)06-0168-04收稿日期:2007-10-22作者简介:本科,助教,研究方向:毕赤酵母基因表达。
巴斯德毕赤酵母)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成包涵体、背景蛋白多、表达量不很高等缺陷;弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂,表达水平低,生产造价昂贵的不足,还具有其它酵母表达系统无法比拟的优越之。但是酵母为高好氧微生物,在发酵过程中常常会出现供氧不足而限制了细胞密度的情况。透明颤菌血红蛋白(inVHb)是一种类似于人血红蛋白的胞内可溶物质,它能够从分子水平上提高工程菌对氧气的利用能力。基于此种特VHb已经在α-淀粉酶、青霉素酰化酶及PHB等多种产品发酵中成功应用。甜蛋白是存在于西非热带植物insii浆果中的一种天然甜味蛋白,其甜度为等质量蔗糖的300倍。的吸收和利用不依赖于胰岛素,不存在类似糖精食用安全性问题,而且由于甜度高、低热量的特点,的需求不断增长。早在20世纪80年代就开始了基因工程表达的研究发酵条件优化是提高外源蛋白在酵母中表达水平的重要环节。
本研究对构建的基因重组酵母菌的发酵条件进行优化,希望进一步提高的分泌表达量。材料与方法111材料与仪器重组毕赤酵母GS115//本校构建保存;YPD培养基1%酵母提取物,2%胰蛋2%葡萄糖;BMGY培养基1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,/L磷酸缓冲液,1134%YNB,%,1%甘油;BMMY培养基除以015%甲醇代替甘油外,其余成分均与BMGY相同;摇瓶发酵基础生长培养基1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,/L磷酸缓冲液,1134%YNB,%;摇瓶发酵基础诱导培养基1134%YNB,%,/L磷酸缓冲液;发酵罐高密度发酵培养基%磷酸,01093%硫酸钙,1182%硫酸钾,1149%硫01413%氢氧化钾;发酵罐高密度发酵培养基%硫酸铜,01008%碘化钠,013%硫0102%钼酸钠,01002%硼酸,0105%氯化钴,2%氯化锌,615%硫酸亚铁,01025%生物素,015%硫酸。
蛋白电泳仪美国公司;30L发酵罐德国Barun公司。112实验方法11211重组毕赤酵母摇瓶发酵条件的研究100mL培养基装于500mL三角瓶中,接种后在250r/min,28～30条件下进行培养。培养条件的研究设计如下所述,按单因子顺序进行,各项实验重复项优化结果都用于以后的实验。研究与探讨食品工业科技Vol.29,06,年第06期碳源对转化子生长的影响将10mL菌液接入100mL分别以2%葡萄糖,2%甘油,2%甲醇,2%乙醇为碳源的基础生长培养基中,定时取样,监测各种培养基中菌体密度OD600达到1010的时间。生物素浓度对高甜度表达的影响将10mL菌液接入100mL以2%葡萄糖为碳源的基础生长培养基中,培养12h后离心,接入100mL生物素浓度分别为0、2、4、6、810g/L的含有015%甲醇的诱导培养基pH610)上,每隔24h补加015%的甲醇,培养48h,检测菌体生长密度/OD600及上清中总蛋白含量,进行SDS-PAGE电泳,紫外薄层扫描检测上清中高甜度的表达量。接种比率对高甜度表达的影响菌体密度OD600达到1010后,分别将50、100、200、300mL培养基生长的菌体离心,接种到100mL含有015%甲醇,pH610的诱导培养基上,每隔%的甲醇,培养48h,检测菌体生长密度/OD600上清中总蛋白含量,进行SDS-PAGE电泳,紫外薄层扫描检测上清中高甜度的表达量。
甲醇浓度对高甜度表达的影响将生长培养基的菌体等量接入含有甲醇百分比浓度分别为012、015、110、115、210、215的诱导培养基上进行培养,24h后补加相同浓度的甲醇,诱导培养48h后收获发酵液,检测菌体生长密度OD600及上清中总蛋白含量,进行SDS-PAGE电泳,紫外薄层扫描检测上清中高甜度的表达量。 pH 表达的影响以 /L的 Na 为缓冲液,将生长培养基的菌体等量接入pH分别为410、510、610、710、 810的诱导培养基上进行培养。诱导培养 48h后收 获发酵液,检测菌体生长密度 /OD 600 及上清中总蛋白 含量,进行 SDS- PAGE电泳,紫外薄层扫描检测上清 中高甜度 的表达量。 诱导时间对高甜度 表达的影响 将生长培养基的菌体离心后接入诱导培养基 诱导培养66h,每6h取一次样,检测菌体生长密度 OD 600 及上清中总蛋白含量,进行 SDS- PAGE电泳,紫外薄 层扫描检测上清中高甜度 的表达量。
11212重组毕赤酵母 GS115 // 30L发酵罐中的高密度发酵实验首先挑取重组毕赤酵母 GS115 // 的单菌落接 种于15mL YPD液体培养基中, 30摇床振荡培养过 夜,以10%的接种量转接于150mL YPD液体培养基 30摇床振荡培养24h,再以10%的接种量转接于基础培养基中,基础培养基由 10 Basal salt +250 PTM1 +5%(w/v)葡萄糖 +0102%泡敌组 30摇床振荡培养24h,然后以10%的接种量将其接种至30L发酵罐内开始发酵。发酵过程分以下 几个阶段进行: 菌体培养阶段30L 发酵罐内盛放 15L 础培养基,基础培养基由 salt +250 PTM1 +4%(w/v)葡萄糖 +0102%泡敌组成,以10%的接 种量接种种子液,用 28%的氨水 (氨水同时也作为菌 体生长的氮源 )控制培养基的 pH在 510左右, 30 通风搅拌培养24h左右。在培养过程中随着菌体的 生长,培养基中的溶氧量将由 100%逐渐降低,当碳 源消耗完后溶氧量将再度升高至 80%以上,此时菌 100g/L左右。
这种培养基中的碳源葡 萄糖是一种非诱导型碳源 生长在这种培养基中重组甲醇酵母工程菌只能进行细胞分裂、增殖,细胞密 度增加,而表达外源基因被完全抑制。 碳源饲喂阶段通过蠕动泵进行限制性的 甘油补料,补料液内含50%甘油 +12mL 补料时间为4h, 调整通气量 使溶氧量始终大于20%。 碳源 甲醇混合饲喂阶段流加50% 甘油甲醇( 41)培养4h, 控制溶氧量始终大于 20%, pH 控制在 515～518。诱导型 碳源 (甲醇)开始缓慢地补入发酵罐 ,发酵罐内菌体 密度再进一步增加, 甲醇诱导启动子的抑制状态在 逐步解除。 诱导表达阶段流加 100%甲醇 +12mL PTM1,使甲醇浓度始终维持在013%, 溶氧量始终大 于20%。在整个诱导过程中每隔 12h取一次样,检 测湿菌体重量及上清中总蛋白含量 进行SDS- PAGE电泳, 紫外薄层扫描检测上清中高甜度 的表达量。 2结果与分析 211 转化子摇瓶发酵培养条件的研究 21111碳源对转化子的影响通过分析生长培养基 中不同碳源对重组酵母生长的影响后发现 体在含有2%葡萄糖的培养基上生长旺盛,12h OD 600 值达到10,在含有甘油的培养基上生长 14h OD
