实验一摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件 13页

由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。(2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，离心机 四．操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支。

实验一 微生物(酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才实验员: 张继泰)一．实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三．仪器与试剂 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、。四．实验方法 (1)、培养基的配制(见表,2) 表1 正交表试验设计 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表实验方案葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) （D）0h? (1) (1) (1) (1)2 (1) (2) (2) (2)3 (1) (3) (3) (3)4 (2) (1) (2) (3)5 (2) (2) (3) (1)6 (2) (3) (1) (2)7 (3) (1) (3) (2)8 (3) (2) (1) (3)9 (3) (3) (2) (1)（2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，于121℃下灭菌30 min，冷却。

（3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。（4）测OD值：将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?实验二 紫外线的诱变育种(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才实验员: 张继泰)一．目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二．基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。(4)10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。(5)10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五．实验结果1．结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间（数/皿）诱变剂 （min）10-410-510-6存活率%致死率%紫外线（UV）0（对照）13结果处理透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理对照六．思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三 玉米淀粉化糖化实验目的掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。掌握还原糖的化学测定二、 实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯)酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。

酶解l步是利用-淀粉酶将淀粉液化为2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。2.1 酶法液化原理淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键。因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为11.1％。（)n+淀粉糖化实际收率：实际收率的计算公式：淀粉转化率：淀粉葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占物DE值。DE值计算：还原糖用测定，浓度表示：葡萄糖100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质100g糖液DE值的因素DE值显著上升；但24h后，当DE值达到90％以上液化DE值与糖化DE的关系液化程度应控制适当，太低或太高均不利。

原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同DE值低故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值DE值应控制在12-18％。用量与糖液DE值的关系糖化酶用量（U/g淀粉）为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严糖化酶参考用量：液化DE值17％淀粉乳33％，60℃，pH45，酶制剂g绝干淀粉。糖化时间6h。实验仪器、设备和材料25升罐小型板框过滤机压滤烘箱玉米粉高温糖化酶pH试纸；四、实验方法4.1 淀粉的液化配制30％的淀粉乳，pH值6.5，加入氯化钙(对固形物02％)，加入液化酶()，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至90℃，并30min，以达到所需的液化程度(DE值：1518％)碘反应呈棕红色液化后，120℃，保持5-8in，以凝聚蛋白质，改进过滤。pH调至42-4.5，同时迅速降温至60℃。加入糖化酶，60℃保温小时后，当用无水酒精检验无pH调至48-5.0，同时，将80℃，保温20in．然后将料液温度降至60-70℃，开始过滤。过滤60-70℃；洗净板框过滤机，装好滤布；接好板框压滤机的管道；(60-70℃)；空气吹干；过滤结束后，洗净过滤机及有关设备。

量取数据处理实验结果和讨论液化和糖化时温度及pH对实验效果的影响1∶1 充分混匀后,用一注射器,将混合液滴入交联剂中, 交联剂的阳离子从外部扩散进入海藻酸钠枯草芽孢杆菌混合液珠内, 将细胞包埋其中。制成凝胶小球，使酵母固定化，用无菌水洗涤固定化细胞，然后加入2% CaCl2，平衡24 h即可使用。（6）固定化细胞的增殖：将固定化细胞转入固定化增殖培养基25℃，pH6下培养。5 实验结果 利用DNS法检测培养液中葡萄糖浓度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。六、思考题1、固定化细胞有何优点和缺点？2、对细胞或者酶进行固定的方法还有哪些？实验五 发酵罐中补料分批发酵研究(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才实验员: 张继泰)一．实验目的加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法。二．实验原理补料分批培养，是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是，可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。

三．菌种与培养基 1.啤酒酵母 2．培养基(g/L) 3.0， 1.0，MgSO4 1.0，pH 5.0。流加的浓葡萄糖液质量浓度为25 g／100 ml。保持培养基中糖的质量浓度在0.5 g/L，流加液的糖的质量浓度为25—30 g/100 m1。四．实验方法 1．流加培养前的准备工作 用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接没有问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气)，确认正常。 2.种子培养 自斜面菌种挑起一环酵母菌体。接入装有0ml 培养基的中，摇匀后，置于℃培养箱培养h。250ml三角瓶装的灭过菌的100ml中，接种量10％，在℃下培养h。 流加培养121℃，20－30 min葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌培养罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,冷却到发酵温度℃。利用硅皮管将25 g/100m1葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。

消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。通气量在3—5 L/min，搅拌转数在接种量10％。开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖，使发酵罐内葡萄糖浓度达到2030g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养掖pH为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10％左右。流加培养7—10h，每隔0.5-1h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度。取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。在发酵过程中消泡剂应尽量少加。 1．菌体量(X) 生物量的测定 550 nm处测定发酵液的吸光值。 （1）画出培养液中酵母菌体量(g/L)随流加培养时间的变化曲线。（）计算酵母产率(质量分数，葡萄糖)。g/L。实验六 机械搅拌罐培养酵母的动力学模型建立(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才实验员: 张继泰)一、实验目的和内容目的：①学习和掌握发酵过程的参数检测；②掌握发酵罐的操作；③掌握发酵过程动力学模型的建立方法内容：①类胡萝卜素发酵过程生物量、产物和底物消耗数据测定；②建立相关生长、底物消耗和产物生成的动力学模型二、实验原理：通过发酵过程测得的实验数据，依据一定的通用、经典参考模型，建立适合某一特定微生物发酵过程的动力学模型。

三、实验步骤：(一)、获得实验数据1. 菌种：粘红酵母4℃保藏于PDA斜面。2. 培养基1.1 PDA培养基：称取新鲜土豆200 g，切丝放进烧杯，加入约500 ml自来水，于电炉上加热至沸腾，煮沸30 min后用两层纱布过滤，收集滤液加入20～30 g葡萄糖，加水至1 L，pH值自然。(斜面制备时加入16～20 g琼脂条)1.2 种子培养基(g/L)：葡萄糖30、酵母浸粉5、 2、 1、MgSO4 2，自来水配制，pH 5.0。1.3 发酵培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母浸粉5、(NH4)2SO4 6、 6、 1、MgSO4 5, pH值自然。3.培养方法3.1菌种活化将一满环斜面保存粘红酵母菌接种于新鲜PDA斜面，25~28℃培养24h。3.2种子制备接种二环活化的斜面菌种于装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，22℃、200 r/min下培养48 h作为种子液。3.3发酵罐发酵按1.2.3制备发酵培养基，每个5 L发酵罐装入培养基2.5 L (即工作体积2.5L)，装好发酵罐送于卧式灭菌锅0.1 MPa灭菌15～20 min，取出发酵罐待冷却至26℃后将上述种子培养基200 mL在火焰保护下接种到发酵罐中，在通气量为0.1vvm、22℃下进行培养，每隔8 h取样一次进行酵母生物量、葡萄糖残留量和类胡萝卜素生成量的分析，培养80 h实验结束。

1.3.3取样与分析方法见附录1至3(二)、动力学模型选择按照经典的发酵动力学模型，对于牛顿性流体发酵的本实验，在满足这些模型的假设条件下选择如下动力学模型的速率函数作为本实验的参考模型（1）（2）（3）（4）(三)、生长、底物消耗和产物合成动力学模型建立采用 7.01软件对数据进行处理，求取上述模型中的μmax、α、β、Ks，将模型简化，代入上述模型中，将上述各式积分，联合求解即可求得发酵过程中生物量、类胡萝卜素产量和底物消耗与发酵时间的函数关系X=M(t)、Q=N(t)和S=L(t)，模型建立完成。测定方法生物量测定参见实验三附录2。残糖测定参见附录1。附录3 类胡萝卜素含量测定取5 mL发酵液6000 r/min离心8 min，蒸馏水洗涤、离心三次，加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于DMSO中，6000 r/min离心8 min，收集上清液于试管中，离心管中再次加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于DMSO中，6000 r/min离心8 min，合并提取液，如此多次直至菌体无色。分光光度计于480 nm处比色，测定总类胡萝卜素含量。

总类胡萝卜素计算公式：类胡萝卜素含量(mg/L)＝1250×Vf×OD480式中：Vf -- 提取液体积；OD480—类胡萝卜素480 nm处吸光值。实验七 (趣味实验) 用纯根霉、酵母制作甜米酒甜米酒亦即醪槽儿，它是用米饭和甜酒曲混合，保温一定时间制成的。其中起主要作用的是甜酒曲中的根霉和酵母两种微生物。根霉是藻菌纲、毛霉目、毛霉科的一属，它能产生糖化酶，将淀粉水解为葡萄糖。根霉在糖化过程中还能产生少量的有机酸（如乳酸）。甜酒曲中少量的酵母菌，则利用根霉糖化淀粉所产生的糖酵解为酒精。所以，甜米酒既甜又微酸还醇香，口感舒适、营养丰富，深受人们喜爱。人们通常采用市售酒曲制作甜米酒。由于市售酒曲质量不够稳定，以致使甜米酒的风味变化较大，有时甚至制作失效，造成浪费。鉴于这种情况，我们在指寻学生进行课外活动时，根据甜米酒的制作原理，采用纯根霉、酵母发酵米饭，从而获得风味纯正、稳定的甜米酒。通过该活动，既使学生知道甜米酒的制作原理和制作过程，获得一些微生物学知识和操作技能，又为甜米酒的大规模生产以及深加工提供一些参考。 1．材料与方法1．1 菌种扩大培养我们使用的菌种是来自中科院成都生物所的根霉3．866，酒酵母1308（1）根霉培养：取大米20g，水60ml，分装几支大试管中，置0．1MPa灭菌15min。

冷却后，在接种箱内接少量菌丝和孢子于米粒上，28～30培养30h左右，待其长出大量孢子时取出备用。（2）酵母培养：取浓度为13°B×麦芽汁，按需量取6N硫酸调节PH值至4．1～4．5。取50ml装入100ml三角瓶中，置0．1Mpa灭菌30min。冷却后，在接种箱内将斜面酵母接1～2环于三角瓶中，28～30培养20～24h。1．2 甜米酒的制作将大米2kg加水浸泡4～8h，待手捏米粒即碎散时，用纱布控干水分，放入带屉的锅中蒸30～40min，即成松散的米饭。一般食堂卖的捞后蒸的米饭也可以，但要分散成粒。待米饭冷却后，分装9个同样大的饭盒内，每盒装200g左右，随意分成A、B、C三组，用3种不同的方式同时进行实验：（1）市售酒曲（对照）：在A组的每个饭盒内，加入1g酒曲（若是块状则研成粉末）与米饭混匀，使其中的根霉孢子分散在全部米饭中。再用干净的匙压平表面，中间留一凹洞，盖上盖，放入27～30环境中。12h后，每隔5h开盖观察，看米饭是否结团变软、变甜，凹洞中是否有水出现。如果米饭变软，表示已糖化好；有水有酒香味，表示已有酒精，即可停止保温。这时最好再蒸一次，杀死其中的微生物和停止酶活动，以便放置取食。

（2）先用根霉糖化，后用酵母发酵：取大试管中的纯根霉菌种3g，加少量冷开水捣成根霉糟液，平均放入B组的3个饭盒内，与米饭混匀后，按（1）所述处理。当米饭结团变软、变甜时，再向每个饭盒内加酵母液1ml，封盖，待有酒味时，再行杀菌，放置取食。（3）根霉与酵母混合：按（1）所述操作。所不同的是，在C组的每个饭盒内，同时加入1g纯根霉菌种和1ml酵母液。 1．3 观察记录 在保温12h后，每隔5h进行观察记录。记录内容包括实验方式、观察时间、米饭变化情况、口味等。上述3种方式保温时间均为30～35h。其中方式（1）米饭结团较差，较甜，微酸。酒味较浓，略带涩味；（2）保温30h左右，米饭变软，凹洞有清水（纯甜），加入酵母2h左右有酒味，结团好，气泡少，甜、微酸、醇香、味道纯正；（3）米饭结团好，较甜，微酸，酒味浓。As of ? 4.0, you can -style to your Web pages using and . You can apply and to HTML , such as text , , and other . are time- that a from one state to . By and with basic , you can and . 5.5 and later a rich of . Click the to see a of many of these and how to are that the of an and the 's . each pixel's RGB color and alpha . Only the used to the is in . The of an with a is not by the .警告：此类已序列化的对象将不再与以后的 Swing 版本兼容。

当前的序列化支持适合在运行相同 Swing 版本的应用程序之间短期存储或 RMI。从 1.4 版开始，已在 java.beans 包中加入对所有 的长期存储支持。请参见 。引用类型和原始类型的行为完全不同，并且它们具有不同的语义。引用类型和原始类型具有不同的特征和用法，它们包括：大小和速度问题，这种类型以哪种类型的数据结构存储，当引用类型和原始类型用作某个类的实例数据时所指定的缺省值。对象引用实例变量的缺省值为 null，而原始类型实例变量的缺省值与它们的类型有关。当JAVA程序违反了JAVA的语义规则时，JAVA虚拟机就会将发生的错误表示为一个异常。违反语义规则包括2种情况。一种是JAVA类库内置的语义检查。例如数组下标越界,会引发ption;访问null的对象时会引发。另一种情况就是JAVA允许程序员扩展这种语义检查，程序员可以创建自己的异常，并自由选择在何时用throw关键字引发异常。所有的异常都是java.lang.的子类。这里我们采用的是Java语言，Java，是由Sun 公司于1995年5月推出的Java程序设计语言和Java平台的总称。用Java实现的浏览器（支持Java ）显示了Java的魅力：跨平台、动态的Web、计算。从此，Java被广泛接受并推动了Web的迅速发展，常用的浏览器现在均支持13