经霉菌（主要是米曲霉）、酵母菌和乳酸菌等微生物及其酶系共同作用而制成的具有独特色、香、味的半固体黏稠状调味品。为其他微生物的生长代谢及黄豆酱特征风味的形成奠定基础。长沙理工大学食品与生物工程学院的孙笑寒、蒋雪薇*等从制酱用成品曲中分离筛选蛋白酶及淀粉酶活性优良的菌株，通过对比研究蛋白酶活性与淀粉酶活性优良菌的单一菌种制曲及混合菌种制曲后的西瓜黄豆酱发酵过程。
西瓜黄豆酱是我国非物质文化遗产，起源于清朝后期豫鲁地区，是一种传统调味品。西瓜黄豆酱主要以黄豆、小麦面粉和西瓜为原料，经霉菌（主要是米曲霉）、酵母菌和乳酸菌等微生物及其酶系共同作用而制成的具有独特色、香、味的半固体黏稠状调味品。米曲霉是西瓜黄豆酱最重要的制曲菌种，其分泌的丰富酶系能有效降解淀粉及蛋白质原料，为其他微生物的生长代谢及黄豆酱特征风味的形成奠定基础。
长沙理工大学食品与生物工程学院的孙笑寒、蒋雪薇*等从制酱用成品曲中分离筛选蛋白酶及淀粉酶活性优良的菌株，通过对比研究蛋白酶活性与淀粉酶活性优良菌的单一菌种制曲及混合菌种制曲后的西瓜黄豆酱发酵过程，考察其不同制曲方式对西瓜黄豆酱的理化指标、挥发性风味物质以及感官评分的影响，探索米曲霉不同酶活性优良菌与西瓜黄豆酱风味物质形成的关系，以期从滋味、香气、色泽、体态四方面提高豆酱品质，为工业化生产质优的西瓜黄豆酱奠定基础。
1、产蛋白酶、淀粉酶优良菌株的初筛
从成品曲中分离米曲霉，在PDA平板上挑选生长良好的单菌落进行分离纯化，筛选出38 株米曲霉，命名为CS3.01～CS3.38。将38 株菌株发酵液接种于牛津杯中，考察其分解上层平板中蛋白质及淀粉能力大小，反映其蛋白酶及淀粉酶活性强弱。如图2所示，比较牛津杯水解圈直径大小，发现4 株菌株的2 种水解圈直径均较大。其中蛋白酶初筛平板中直径大小依次为CS3.22＞CS3.04＞CS3.31＞CS3.12；淀粉酶初筛平板中直径大小依次为CS3.12＞CS3.04＞CS3.22＞CS3.31。因此，对这4 株菌株进行制曲酶活性验证。
2、产蛋白酶、淀粉酶优良菌株的复筛
从图3可以看出，4 株菌株的蛋白酶活性均在制曲72 h达到最大，酶活性大小为CS3.22＞CS3.04＞CS3.31＞CS3.12，其中CS3.22蛋白酶活性最大，为3 132.16 U/g。淀粉酶活性在制曲60～72 h达到最大，酶活性大小为CS3.04＞CS3.22＞CS3.12＞CS3.31，其中CS3.04淀粉酶活性最大，为107.60 U/g。这与牛津杯法初筛的结果基本保持一致，说明其结果具有真实性和可靠性。通过比较4 株菌蛋白酶和淀粉酶的测定结果，发现CS3.22和CS3.04分别是产蛋白酶和淀粉酶优良菌株，有利于降解原料中蛋白质和糖类等大分子物质，提高氨态氮及还原糖含量，改善黄豆酱滋味，故对CS3.22和CS3.04进行鉴定及后续发酵研究。
3、菌种鉴定
形态学鉴定
如图4所示，2 株菌的菌落均呈黄绿色，丝绒质地，菌丝短且疏松。显微镜观察菌体形态，CS3.04、CS3.22两株菌具有分生孢子梗，底端有明显的足细胞；顶端有球形顶囊，其表面长出辐射状小梗，分生孢子串生。根据菌落及菌体形态，初步判断所筛选的2 株菌为米曲霉。
ITS rRNA序列分析
2 株菌的分子生物学鉴定结果如图5a所示，CS3.04和CS3.22扩增片段的长度约为600 bp，条带清晰。将2 株菌PCR扩增产物进行ITS序列分析，建立系统发育树，如图5b所示，CS3.04和CS3.22 ITS序列相似度高，聚为一类，结合形态学特征，鉴定均为米曲霉（ ）。
4、制曲发酵西瓜黄豆酱
不同制曲方式发酵西瓜黄豆酱过程中理化指标的变化
如图6a所示，在0～30 d还原糖含量呈先上升后下降的趋势，由于西瓜中糖类物质含量较高，使得在发酵起始期就明显高于传统黄豆酱得还原糖含量。在10 d还原糖含量均达到最高值，大小依次为S3＞S1＞S2＞S0，其中S3为107.37 g/kg，比S0提升了11.02%。主要是由于CS3.04淀粉酶活性较高，有利于将原料中淀粉等大分子物质分解为小分子糖类物质，使还原糖含量增加较快。随着发酵体系中各种微生物生长活动逐渐旺盛，还原糖作为主要碳源被不断利用，使还原糖含量逐渐下降。
如图6b所示，氨态氮含量逐渐增加，在25 d氨态氮含量大小依次为S3＞S2＞S1＞S0，S3在30 d达到6.76 g/kg，符合GB 2718—2014要求（氨态氮≥5.00 g/kg），比S0提升了5.56%。说明具有较强中性蛋白酶活性的CS3.22，水解蛋白质产生游离氨基酸的能力优于CS3.04及市售米曲霉，有利于提高氨态氮含量。
如图6c所示，总酸含量呈先增加后降低的趋势，总酸含量大小依次为S0＞S1＞S2＞S3。在15 d，S0的总酸含量最高为3.77 g/kg，总酸含量过高，超过适口浓度，并不利于西瓜黄豆酱品质提升。
不同制曲方式发酵西瓜黄豆酱的香气成分分析
西瓜黄豆酱的香气物质主要来源于制曲和发酵2个阶段，原料、菌种、制曲方式、发酵工艺都对香气组成有重要影响。发酵结束时，分析4 种西瓜黄豆酱的挥发性风味物质，结果如表2所示（点击下方阅读原文即可查看表2）。4 种不同制曲方式发酵的西瓜黄豆酱共检测到54 种物质，其中醇类11 种、酯类13 种、酸类9 种、酚类8 种、醛类5 种、酮类4 种、其他物质4 种。不同制曲方式对西瓜黄豆酱挥发性风味物质的种类影响不显著，但对其含量具有显著影响。
不同制曲方式发酵西瓜黄豆酱的感官评定结果
如图7所示，感官总分排名次序为S3＞S2＞S1＞S0。滋味上，S2和S3优于S0和S1，说明蛋白酶活性对西瓜黄豆酱滋味具有显著影响，与氨态氮含量趋势结果保持一致。香气上，S3＞S2＞S1＞S0，这与挥发性风味物质含量测定结果不同，可能是由于不同风味物质香气阈值存在差异，对于未达到其阈值的风味物质，则无法被嗅闻到。色泽及体态上，S3评分均高于其他3 组。说明CS3.04、CS3.22能够改善西瓜黄豆酱的品质，并且通过混菌制曲发酵可以达到最佳效果。
结 论
本研究筛选获得1 株淀粉酶活性优良米曲霉CS3.04和1 株蛋白酶活性优良米曲霉CS3.22，将2 株菌株以不同制曲方式应用于西瓜黄豆酱发酵中，与单一菌种制曲发酵相比较，混合菌种制曲发酵中在理化指标、挥发性风味物质以及感官评定均占有一定优势。混合菌种制曲发酵过程中，淀粉酶与蛋白酶发挥互补协同作用，提供丰富的糖类及氨基酸等小分子前体物质，使还原糖及氨态氮含量有所提升，有利于生成醛类、醇类、酮类及短链酯类等花果型香气物质。研究发现，淀粉酶活性优势菌CS3.04与蛋白酶活性优势菌CS3.22混合菌种制曲发酵西瓜黄豆酱的工艺能为解决豆酱甜感不足、香气寡淡等问题提供一条新的途径，具有良好的应用潜力。
本文《米曲霉优良菌株的筛选及在制曲发酵西瓜黄豆酱中的应用》来源于《食品科学》2022年43卷6期204-211页，作者：孙笑寒，蒋雪薇，肖智予，欧德冲，李开，周慧，方勤军。DOI:10.7506/-059。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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